PCR反應一般設置20~40次循環,每一循環包括高溫變性、低溫退火、中溫延伸三步反應。每一循環的產物作為下一個循環的模板。PCR的擴增效率很高,如果循環次數是30次,那么新生DNA片段理論上達到230拷貝(約為109個分子)。PCR反應每個循環的三個基本反應步驟如下:
①模板DNA的變性:模板DNA經加熱至94℃左右一定時間后,使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA產物解離,使之成為單鏈,以便它與引物結合,為下輪反應作準備;
②模板DNA與引物的退火(復性):模板DNA經加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合;
③引物的延伸:溫度升到72℃左右,DNA模板-引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP為反應原料,靶序列為模板,按堿基配對與半保留復制原理,合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈。重復循環變性-退火-延伸三過程,就可獲得更多的“半保留復制鏈”,而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2~4分鐘,2~3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。到達平臺期所需循環次數取決于樣品中模板的拷貝。